CCK8

服務(wù)介紹：

操作步驟

1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定細(xì)胞具體數(shù)量時進(jìn)行次操作）

A) 先用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。
B) 按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細(xì)胞濃度梯度，一般要做 3-5 個細(xì)胞濃度梯度，每組 3-6 個復(fù)孔。
C) 接種后培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，然后加 CCK-8 試劑培養(yǎng)一定時間后測定 OD 值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X軸），OD 值為縱坐標(biāo)（Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（試用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時間）。

2. 細(xì)胞活性檢測

A) 在 96孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在 37℃，5% CO₂ 的條件下）。

B) 向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 OD 值的讀數(shù)）。

C) 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2小時。

D) 用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。

E) 如果暫時不測定 OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24 h內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

3. 細(xì)胞增殖-毒性檢測

A) 在 96 孔板中配置 100 μL 的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24 小時（在 37 ℃，5% CO2 的條件下）。

B) 向培養(yǎng)板加入 10 μL 不同濃度的待測物質(zhì)。在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間（例如：6、12、24 或 48 小時）。

C) 向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 OD 值的讀數(shù)）。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。

D) 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2小時。

E) 用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。

F) 如果暫時不測定 OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCl 或者 1% SDS (W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24 小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

4. 活力計算：.

細(xì)胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0 加藥)－A(空白)]×100

A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培養(yǎng)基和 CCK-8 溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度

A（0 加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力